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  • 原位雜交組織化學對照實驗

    為證明原位雜交實驗操作的準確性和實驗結果的可靠性,必須設置一系列對照實驗。對照實驗的設置應根據核酸探針和靶核酸的種類以及現有的可能條件選定。一般應在下述幾種對照實驗中選擇3~4種,以證實雜交結果的可信性。

        (一)組織對照
        1.Southern或Northern印跡反應  原位雜交能在組織細胞原位顯示待測核酸(DNA或RNA)的存在。為了進一步證實原位雜交所顯示的核酸是否存在于被檢組織內,可從被檢組織中提取DNA或總RNA,然后分別用Southern或Northern印跡法進行檢測。一般情況下,Southern或Northern印跡反應結果與原位雜交結果一致,兩者互相支持。但是,當陽性細胞在被檢的組織中所占比例很小時,原位雜交結果可能為陽性,而印跡反應則由于靶核酸的含量太低而呈陰性結果。
        2.免疫組織化學  如果能獲得靶基因產物抗體,可結合免疫組織化學方法,從蛋白質(或多肽)水平在相鄰切片或同一切片中證明蛋白質(或多肽)和相應的mRNA共存于同一細胞中。
        (二)探針對照
        1.已知陽性組織和已知陰性組織對照  用探針在已知含靶核酸序列的陽性組織和已知不含靶核酸序列的陰性組織標本上進行原位雜交,應分別得到陽性結果和陰性結果。如果已知陽性組織出現陰性結果,則應對探針的制備及原位雜交的各個步驟進行檢查。相反,如已知陰性組織出現陽性結果,則提示存在非特異性雜交信號。
        2.用有意義鏈RNA探針做原位雜交  因為無意義鏈RNA的堿基序列與靶mRNA堿基序列互補,故檢測組織細胞中的mRNA時常用無意義鏈RNA探針(反義RNA探針)進行原位雜交。而有意義鏈RNA探針堿基序列則與靶mRNA的序列相同,因此,用有意義鏈RNA探針進行原位雜交應得到陰性結果,這一陰性對照實驗是證明探針特異性的很好方法。
        3.吸收實驗  將標記探針先同與之互補的DNA或RNA雜交,然后再進行原位雜交,結果應為陰性。此實驗類似于免疫組織化學的吸收實驗。
        (三)雜交反應對照
        1.空白實驗  在進行原位雜交時,將雜交液中除去標記探針,結果應為陰性。這是一項簡便而有意義的陰性對照。
        2.雜交前用核酸酶預處理標本  根據靶核酸是DNA或RNA,對被檢測的標本用DNA酶或RNA酶進行預處理以消化被檢核酸,然后再進行原位雜交。與未經DNA酶或RNA酶預處理的標本相比,如果雜交信號明顯減弱,則證明標記探針與未經酶預處理標本中的DNA或RNA之間有雜交體形成。通常以核酸酶預處理標本并不能使雜交信號完全消失,要完全消化靶DNA或RNA則需要對酶的濃度和消化時間等因素反復摸索后才能實現。在做此項對照實驗時應注意在核酸酶處理后,需把加在標本上的酶清除干凈,以免殘留的酶破壞探針而導致錯誤結論。 
        (四)檢測系統對照
        1.放射自顯影檢測系統對照  放射性核素自顯影對照包括空白片的陽性對照和陰性對照。陽性對照是將浸漬乳膠的空白片在光線下曝光后顯影,陽性結果證明乳膠及顯影過程工作正常。陰性對照是將空白片浸乳膠后不經曝光便與原位雜交標本一起進行顯影,結果應為陰性。如果陰性對照片上有較多銀粒,則說明乳膠有放射性污染,應丟棄并換用新乳膠。
        2.非放射性原位雜交檢測系統對照  絕大部分的非放射性原位雜交反應是以免疫組織化學方法進行顯示的,在對照實驗中應包括免疫組織化學的一系列陽性對照和陰性對照。
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